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正文:

2.樣品染色　　
(1)準(zhǔn)備正控制組：吸取 10 μL 含 200 至 400 個(gè)的孢子至玻片（Dynal 公司產(chǎn)品）上當(dāng)作正控制組�！� 　 (2)準(zhǔn)備負(fù)控制組：吸取 50 μL 150 mM PBS 至玻片上當(dāng)負(fù)控制組�！� 　

(3)將上述玻片風(fēng)干。　 　

(4)各加一滴的檢測(cè)劑量（Detection Reagent）至樣本玻片上。（Meridian 公司的測(cè)試套組或同級(jí)品）　 　 (5)加一滴的對(duì)比染劑量（Counterstain）至樣本玻片上。（Meridian 公司的測(cè)試套組或同級(jí)品）　 　

(6)將玻片在暗處?kù)o置 30 分鐘，最好是用一個(gè)可密封的塑料盒，盒內(nèi)放置一張濕的紙巾�！� 　

(7)加入一滴一倍的洗劑（wash buffer）,（此由 20 X 的洗劑稀釋得來(lái)）。傾斜玻片，以清潔的紙巾及無(wú)菌吸管將多余的試劑吸去。注意不要碰觸到樣本且不得使玻片干燥�！� 　
(8)加入 50 μL 的 DAPI 染劑至玻片上，染色一分鐘。傾斜玻片，以清潔的紙巾及無(wú)菌吸管將多余的試劑吸去。注意不要碰觸到樣本且不得使玻片干燥�！� 　
 (9)加入一滴的封片液蓋上蓋玻片，用紙巾吸去玻片周圍多余的封片液。　 　

(10)以熒光為光源的微分干涉差顯微鏡進(jìn)行鏡檢并計(jì)數(shù)，如果無(wú)法馬上觀察計(jì)數(shù)，樣本玻片必須保存在 0 至 8 ℃ 的暗處，同時(shí)要有保濕的處理，不能使玻片干燥。

八、結(jié)果處理（一）顯微鏡鏡檢觀察與計(jì)數(shù)　

1.正控制組的玻片在熒光顯微鏡下以 200 倍的倍率下觀察，可見(jiàn)到蘋果綠原蟲。負(fù)控制組則否�！�
2.隱孢子蟲在顯微鏡下是有亮度的蘋果綠顏色，大小約 4 至 6 μm，卵形或圓形。周圍有一圈明亮的光環(huán)�！�
3.將光源轉(zhuǎn)為

DIC：原蟲可能會(huì)有如下的特征：　　 (1)1 至 4 個(gè)清晰、天藍(lán)色的細(xì)胞核　 　 (2)細(xì)胞質(zhì)可染上藍(lán)色　 　 (3)淡藍(lán)色的細(xì)胞質(zhì)、沒(méi)有明顯的細(xì)胞核　 　 （1）、（2）紀(jì)錄為 DAPI ＋;（3）紀(jì)錄為 DAPI －　

4.使用 DIC 顯微鏡觀察非典型的隱孢子蟲孢囊體：例如刺狀物、柄、附屬構(gòu)造、洞、一或兩個(gè)細(xì)胞核充滿整個(gè)細(xì)胞、紅色熒光的細(xì)胞質(zhì)、結(jié)晶或孢子等�！� 5.如果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非典型的囊孢體構(gòu)造，具蘋果綠熒光之目標(biāo)物可能為：　　
 (1)空的隱孢子蟲孢囊體　 　 (2)模棱兩可的隱孢子蟲孢囊體　 　 (3)隱孢子蟲孢囊體含有內(nèi)容物如 1 ～ 4 個(gè)小孢子（sporozoites）在 1000 倍的放大倍率下 記錄形狀、量測(cè)大小及含有小孢子（sporozoites）之孢囊體的數(shù)目。　

6.梨形鞭毛蟲在顯微鏡下為具亮度的蘋果綠顏色，卵形或圓形，長(zhǎng)為 8 ～ 18 μm，寬為 5 ～ 15 μm，周圍有一圈明亮的光環(huán)。　

7.將 UV 光源轉(zhuǎn)為 DIC 時(shí)：原蟲會(huì)有如下的特征　　 (
1)2 至 4 個(gè)清晰、天藍(lán)色的細(xì)胞核　 　 (2)細(xì)胞質(zhì)可染上藍(lán)色　 　 (3)淡藍(lán)色的細(xì)胞質(zhì)、沒(méi)有明顯的細(xì)胞核　 　 （1）、（2）紀(jì)錄為 DAPI ＋;（3）紀(jì)錄為 DAPI　

8.使用 DIC 顯微鏡觀察非典型的梨形鞭毛蟲卵孢子：例如刺狀物、柄、附屬構(gòu)造、洞、一或兩個(gè)細(xì)胞核充滿 整個(gè)細(xì)胞、紅色熒光的細(xì)胞質(zhì)、結(jié)晶或孢子等�！� 9.如果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非典型的梨形鞭毛蟲卵孢子，則將有亮度的蘋果綠顏色的目標(biāo)物應(yīng)為梨形鞭毛蟲的卵孢子。在 1000 倍的放大倍率下記錄形狀、量測(cè)大小及數(shù)目。

（二）復(fù)雜樣本的分析　 1.如果樣品的蟲數(shù)過(guò)高 --- 超過(guò) 1000 / 公升，或是水中濁度過(guò)高，導(dǎo)致濾心的阻塞以致于無(wú)法進(jìn)行流洗濃縮時(shí)，可以稀釋的水樣重新檢驗(yàn)�！� 2.如果水樣的過(guò)濾體積無(wú)法達(dá)到規(guī)定的 10 公升，可用試劑水稀釋至 10 公升再行過(guò)濾。　 3.如果采樣至檢驗(yàn)的時(shí)間超過(guò)規(guī)定之期限，則放棄此水樣，重新采樣送檢。九、質(zhì)量管理（一）每一實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行本方法時(shí)均需建立質(zhì)量保證計(jì)劃。最基本之要求包括精確度、回收率等績(jī)效測(cè)試 數(shù)據(jù)，并以添加樣品及空白作持續(xù)性評(píng)估。實(shí)驗(yàn)室同時(shí)須建立績(jī)效測(cè)試之評(píng)估基準(zhǔn)，以評(píng)估分析數(shù)據(jù)結(jié)果之可靠性。（二）微量吸管校正　 1.微量吸管每年送外校一次，并保有外校結(jié)果紀(jì)錄。如實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員經(jīng)考核具校正能力，內(nèi)校亦可�！� 2.如對(duì)微量吸管之校正有疑問(wèn)，可以 100 ％、50 ％、10 ％ 之試劑水以分析天平作校測(cè)試，誤差在 1 ％ 以內(nèi)仍可接受。十、精密度及準(zhǔn)確度