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正文:

冷凍切片法

前準(zhǔn)備器材及消耗品
冷凍切片機(jī)
subbing 載玻片
冷凍包埋劑 (cryo tissue embedding compound)
明視野顯微鏡
解剖顯微鏡
 
解剖顯微鏡生物標(biāo)本之物理脫水及化學(xué)急速脫水法

物理脫水法：
    已固定之標(biāo)本經(jīng)洗滌后將固定液洗除后即可進(jìn)行脫水及包埋于石臘或塑料中。脫水之步驟是以脫水劑如乙醇或丙酮由低濃度漸進(jìn)至高濃度以物理取代之方式將組織中的水置換出來，使標(biāo)本最終達(dá)到無水之狀態(tài)。由于脫水劑系有機(jī)之藥品且組織內(nèi)外急劇的濃度改變，產(chǎn)生物理性之壓差易造成組織形態(tài)上的改變，因此起始之脫水濃度及每一步驟之濃度差，需參考材料之軟硬程度或組織是否為分生組織等纖細(xì)之性質(zhì)。一般而言較細(xì)嫩的材料，如作細(xì)胞觀察或電子顯微鏡標(biāo)本之制備，須由較低濃度開始脫水如10％，且每一步驟之濃度差距須較小如10-20％。而較硬的成熟組織或作一般組織觀察之目的，則可由較高濃度開始脫水如30％，且每一步驟之濃度差距可較大如20-30％。此外，起始脫水濃度和固定液的使用濃度需相近。常用的酒精脫水系列之濃度為10％－30％－50％－70％－85％－95％－100％，每一步驟之脫水時(shí)間可視材料大小而異，小材料如細(xì)胞或根尖，可以30分鐘-1小時(shí)為一級(jí)距，大材料塊則以4-8小時(shí)為一級(jí)距。有些材料經(jīng)脫水后呈透明無色狀，可于脫水過程中加入erythrosin或toludine blue同時(shí)進(jìn)行表面之染色，使材料經(jīng)包埋后易于辨認(rèn)其外形或上下方向。染料于何時(shí)加入進(jìn)行染色，則視其最佳溶解度，需與溶劑的濃度相配合，如toludine blue則適合于純TBA時(shí)加入少許進(jìn)行染色。材料經(jīng)包埋切片后黏貼于載玻片上，其脫水之情形大致同上述。
上述的物理脫水法過程繁復(fù)費(fèi)時(shí)且總程時(shí)間冗長(zhǎng)，但效果穩(wěn)定可靠分別為其缺點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)。
化學(xué)脫水法：
另一種原理完全迥異的脫水法稱為化學(xué)急速脫水法（Lin et al. 1977）。它是基于化學(xué)反應(yīng)之原理，A＋B     C＋D若Ａ代表組織中所含的水，B是脫水劑，經(jīng)反應(yīng)后生成不同的化學(xué)產(chǎn)物C和D，于是組織中的水于瞬間完全消失而達(dá)到脫水的目的。反應(yīng)中使用的脫水劑可以是雙甲氧基丙烷2,2-dimethoxypropane（DMP）或雙乙氧基丙烷2,2-diethoxypropane（DEP）。進(jìn)行下式之反應(yīng)
    CH3                                      O
          ∣                                       ∥
H3CO－C－OCH3  ＋  H2O      2 CH3OH  ＋CH3－C－CH3
          ∣
          CH3 
               
        2,2-DMP＋H2O                methanol  ＋  Acetone
此反應(yīng)所用之DMP需經(jīng)酸予以酸化，進(jìn)行此步驟可于25 ml之DMP中加入3滴（每滴約0.06 ml）之0.1 N HCl即足夠，若過度的酸化，將使脫水之組織其蛋白分子上羧基之H離子被生成物甲醇之甲基取代而形成所謂之甲基化，經(jīng)甲基化之組織將失去蛋白分子被染料分子染色的性質(zhì)，而形成負(fù)染之現(xiàn)象，應(yīng)予避免，除了上述避免過度酸化外亦可將脫水步驟快速重復(fù)三次（每次5分鐘），如此即可將生成物移去，而排除形成甲基化之機(jī)會(huì)。
    由于化學(xué)脫水之產(chǎn)物甲醇及丙酮，均為物理脫水之最終目的產(chǎn)物，因此理論上脫水過程系于瞬間完成，且水一碰上脫水劑之瞬間就完成反應(yīng)，因此物理脫水過程中，因濃度差異所造成之物理壓差并不存在，皆為此方法之優(yōu)點(diǎn)。
化學(xué)急速脫水之簡(jiǎn)略參考流程如下：
2％glutaraldehyde固定液，以0.1 M cacodylate緩沖液pH 7.4配制
在4℃固定1小時(shí)
↓
以0.1 M cacodylate緩沖液淋洗3次，每次5分鐘
↓
以2％OSO4之水溶液進(jìn)行后固定1小時(shí)
↓
以二次蒸餾水淋洗3次，每次5分鐘
↓
以酸化的DMP脫水，15分鐘內(nèi)更換3次新配的DMP
↓
（以100％之丙酮取代DMP）
↓                                   ↓                  ↓
塑料包埋                          石臘包埋         臨界點(diǎn)干燥
↓                                   ↓                  ↓
超薄切片       2 切片              8－30切片         鍍金
↓              ↓                   ↓                  ↓
鈾及鉛染色  Toludine Blue染色   Safranin, Fast Green染色 SEM觀察
↓              ↓                   ↓
TEM觀察       LM觀察             LM觀察