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正文:

免疫金之免疫組織化學法
1. 免疫光學顯微鏡術
1. 固定：小片組織放入下列固定液：2％對位甲醛（paraformaldehyde），1.25％戊二醛（glutaraldehyde），以50 mM PIPES pH 7.2之緩沖液配制，含2 mM CaCl2。把組織樣品在4℃下固定12-24小時。
2. 包埋：用50 mM PIPES緩沖液沖洗被固定的組織3次，每次15分鐘。以酒精系列進行脫水（30、40、50、60、70、80、95、100％×2酒精）；每個步驟10到15分鐘。將組織以石臘包埋。避免溫度超過58℃以上。
3. 切片：切下厚度5 m并黏貼在載玻片上。使用卵蛋白素（ovalbumin）或組織黏著物當作黏劑。若以Poly-L-lysine當黏著劑會有較深的背景色。假如可獲得干凈的載玻片就不要使用任何黏著劑。因為黏著劑會有一些背景顏色。
4. 脫臘：以二甲苯（xylene）脫臘
     二甲苯I  5分鐘
     二甲苯II  5分鐘
5. 水化：依序以系列酒精水化：
     95％酒精  5分鐘
     95％酒精  5分鐘
     85％酒精  5分鐘
     70％酒精  5分鐘
     50％酒精  5分鐘
     蒸餾水  5分鐘
6. 清洗和染色：
(1) 此反應需在潮濕狀態(tài)下完成，且使用抗體的量盡量減到最少的程度，
   即要在最少量緩沖液中完成反應。
(2) 用PBS清洗                         5分鐘×2
(3) 將載玻片平放，取Blotto 50-200 l覆蓋在材料上，浸泡20分鐘到1小
   時。
(4) 以PBS沖洗。
(5) 加50-200 l的一級抗體（以Blotto適量稀釋或以preimmune serum當對
   照）于材料上。
(6) 以PBS沖洗。              15分鐘×4
(7) 加ImmunoGold（或protein A）于材料上。1小時（以Blotto稀釋）。
(8) 以PBS沖洗。                  15分鐘×3
(9) 用蒸餾水沖洗。                   15分鐘×3
(10) 將切片放在通風處使其干燥，讓其夠牢固以完成接下來的步驟。
7. 銀粒子強化反應：此處理步驟將免疫金粒子（步驟）經由銀粒子予以強化放大，使它可以在顯微鏡下觀察。此反應依廠商（Amersham Enhance M or Sigma Silver enhancer Kit）所附的操作說明進行即可。
8. 復染：將切片以0.5％SafraninO或Delafield Haematoxyliny淺染色幾秒鐘（3-5秒），使組織輪廓可在顯微鏡下觀察。
9. 封片：滴一滴洋杉油在切片上進行封片，或暫時以指甲油封住蓋玻片的四周，此時制片工作即告完成。

試劑制備：
1. PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline, PBS 10 mM）將下列鹽類溶于100 ml水中：8 g NaCl、 0.2 g KCl、 1.44 g Na2HPO4•2H2O和0.2 g KH2PO4。
2. Blotto：PBS含0.1％BSA及0.05％sodium azide的PBS，并調整pH為7.2。
3. Preimmume serum：5％heat-inactivated normal serum（from the same species as that in which the gold-conjugated secondary antibody was raised）在Blotto中。
4. 免疫金（Immuno Gold or Auro ProbeLM or protein A）用40倍的Blotto溶液稀釋。
5. Silver enhancer：solution A：B=1：1，使用前再溷合。solution A as enhancer, solution B as initiator。