梨形鞭毛蟲與隱孢子蟲檢測方法 －過濾濃縮 / 免疫磁性抗體分離 / 免疫熒光抗體分析法

一、方法概要　　本方法應(yīng)用于水中梨形鞭毛蟲（Giardia）及隱孢子蟲（Cryptosporidium）之定性與定量檢測。用過濾方式將 10 ～ 20 公升水樣中之梨形鞭毛蟲與隱孢子蟲收集于濾管上。以流洗液沖洗之后離心，經(jīng)磁性抗體分離純化，所得之蟲體再以熒光標記之單株抗體及4’,6 - diamidino - 2 - phenylindole（DAPI）染色，在具有微分干涉差（Differential Interference Contrast, DIC）的熒光顯微鏡下觀察計數(shù)。鏡檢作定量計數(shù)時必須就蟲體之形狀、大小、顏色與熒光強度與標準品作比對。

二、適用范圍　　本方法適用于地表水、地下水、飲用水、水源水質(zhì)等水樣中梨形鞭毛蟲及隱孢子蟲之檢測。但不適用于高濁度及含干擾物質(zhì)水樣之檢測。
三、干擾
（一）無機物及有機物分解造成之碎片會在過濾、分離及鏡檢時造成各種程度的干擾；黏土會影響鏡檢之觀察；凈水處理系統(tǒng)中添加的化學物質(zhì)如鐵鋁等混凝劑及高分子物質(zhì)也會造成干擾。
（二）藻類及酵母菌所產(chǎn)生的非特異自發(fā)性熒光常會在熒光顯微鏡的觀察時造成偽陽性的誤判。
（三）溶液、試劑、玻璃容器及其它采樣過程中可能因人為操作之失誤而在鏡檢觀察時造成誤判，因此在實驗流程必須同時進行一組方法空白即負控制組（Negative control sample）以作為比對。檢驗中如有更換試劑水或檢測試劑時，亦應(yīng)考慮進行空白組試驗。
（四）在樣品分離過濾的過程中有些藻類、細菌及原生動物會伴隨著目的原蟲同時被分離出來，造成鏡檢觀察計數(shù)之干擾。
（五）水樣、濾管、流洗液、離心濃縮及玻片可能含有影響卵囊及休眠體鑒別之因子，因此必須進行背景負控制組。

四、設(shè)備及材料
（一）10 至 15 公升的水桶，在 10.0、15.0 公升之處應(yīng)有刻度。
（二）攪拌棒：不銹鋼或塑料制，可作為水樣攪拌用者。
（三）血球計數(shù)器及蓋玻片：可作為原蟲計數(shù)用者。
（四）拭鏡紙：不含硅質(zhì)者。
（五）PP 或 PE 材質(zhì)之塑料平底螺旋試管，5 ～ 50 mL。
（六）濾管：商品名為 Envirochek 或其同級品，材質(zhì)為 polyethersulfone。直徑約 6 公分，長 21 公分，孔徑為 1.0 μm，大約為 1300 平方公分的過濾面積。
（七）懸臂式震蕩器：含有側(cè)棒可以固定濾管，作為濾管中原蟲之震蕩分離者。
（八）采樣器連接管：玻璃、PTFE 或 HDPE 材質(zhì)，不易使原蟲附著其上者。
（九）流量計及流量計流量控制閥：0.5 gpm 或每秒流速可控制在 0.3 公升者�；蚋接忻棵� 0.4 ～ 4 公升的流速附控制閥者。
（十）抽氣馬達：1 / 4～1 / 2 HP 均可。
（十一）磁性抗體樣品混合磁座（MPC - 1、 MPC - M Dynal 公司產(chǎn)品或其同級品）：可作為免疫磁性抗體套組IMS混合之用。（十二）磁珠濃縮用試管 ：10 mL 之玻璃試管。（Dynal 公司產(chǎn)品或其同級品）
（十三）磁珠濃縮用離心試管：容量約為 10 mL 之塑料離心管。（Dynal 公司產(chǎn)品或其同級品）
（十四）磁珠解離用側(cè)邊扁平試管：6 × 125 mm，側(cè)邊 60 × 10 mm。（Dynal 公司產(chǎn)品或其同級品）
（十五）乳膠手套。（十六）量筒：10、100 及 1000 mL 可高壓滅菌之量筒。
（十七）離心機：懸臂式、可以容納 15 至 250 mL 圓錐底離心管。
（十八）離心管：圓錐底、有刻度、容量 1.5、50 及 250 mL。

（十九）顯微鏡：熒光顯微鏡，含 DIC 裝置。20 倍（N.A. ＝ 0.4）至 100 倍（N.A. ＝ 1.3）放大倍率。DAPI 之激發(fā)波長：340 至 380 nm。
（二十）吸管：使用 5、10、25 mL 之無菌吸管、玻璃或塑料制。
（二十一）天平：分析天平，可以精稱至 0.1 mg 者。　　　上皿天平，可以精稱至 10 mg 者。
（二十二）pH 測定計。（二十三）恒溫培養(yǎng)箱。（二十四）試管振蕩器。
（二十五）抽氣幫浦：可以維持在 25 in.Hg 以上者具有逆止閥及真空度量測計者。

五、試劑
（一）NaOH：試藥級，6.0 及 1.0 N 及 0.1 N。
（二）HCl：試藥級，6.0、1.0 及 0.1 N。
（三）溶劑：丙酮、甘油、乙醇及甲醇，均為試藥級。
（四）試劑水：不含磁性物質(zhì)者。
（五）磷酸緩沖溶液（PBS）：溶解 1 .07 g 的 Na2HPO4，0.39 g 的 NaH2PO4和 8.5 g 的 NaCl 至 800 mL 的稀釋水中，再加至總量為 1000 mL。調(diào)整 pH 為 7.2，保存于 4 ℃ 冰箱中，期限為一星期。
（六）Laureth 12 溶液：稱取 10 g 的 Laureth 12（PG 公司 06194 或同級品）加入 90 mL 的試劑水中，以加熱板或微波爐加熱溶解。分裝 10 mL 至無菌小瓶中 ，室溫下可儲存 2 個月，4 ℃ 冰箱內(nèi)可保存一年以上。
（七）1 M Tris 溶液：稱取 121.1 g 的 Tris 溶于 700 mL 的試劑水中，以 1 N 的 HCl 或 NaOH 調(diào)整至 pH 為7.4。再加試劑水至總量為 1000 mL， 再調(diào)整 pH 至上述值。再以 0.22 μm 濾膜無菌過濾，于無菌塑料瓶，室溫保存以二個月為限。
（八）0.5 M EDTA 溶液：稱取 186.1 g 的 EDTA 溶于 800 mL 的試劑水中，以 6.0 N 的 NaOH 或 HCl 調(diào)整 pH 至 8.0，再加試劑水至 1000 mL，再以 1.0 N 的 NaOH 或 HCl 調(diào)整 pH 至上述值。4 ℃ 冰箱中保存期限為二個月。
（九）消泡劑 A：Sigma 公司 A5758，或同級品。
（十）流洗緩沖液：將（六）Laureth 12 溶液以試劑水稀釋 100 倍，即 10 mL 的原液加 10 mL 的 Tris 、2 mL 的 EDTA 及 150 μL的消泡劑稀釋至總量為 1000 mL。
（十一）IMS 免疫磁性抗體套組：Dynal 公司產(chǎn)品，含梨形鞭毛蟲抗體磁珠、隱孢子蟲抗體磁珠、SL 緩沖液 - A、SL 緩沖液 - B（十二）DABCO / 甘油鏡檢固定液：溶解 2.0 g 的 1,4 - diazabicycle [2.2.2]octane（DABCO, Sigma ＃D - 2522）于 95 mL 的加熱的甘油 / PBS 溶液（60 ％ 的甘油，40 ％ 的 PBS），用磁石攪拌直至 DABCO 完全溶解，再加甘油 / PBS 溶液至 100 mL。保存期限為 6 個月。DABCO 加熱時會產(chǎn)生有毒蒸汽，預(yù)避免吸入或與皮膚、眼晴接觸。
（十三）隱孢子蟲 / 梨形鞭毛蟲免疫抗體檢測標記套組：Meridian 公司產(chǎn)品（品號 250050 或同級產(chǎn)品，含對比染液counterstain、檢測試劑 detection reagent 及洗劑 wash buffer）。儲存于 0 至 8 ℃，不能冰涷，使用前回復(fù)至室溫，本產(chǎn)品須避光保存，試劑稀釋之后保存期限為 48 小時。
（十四）DAPI（4’6’ - diamidino - 2 - phenylindole）染劑：　 儲備液：溶解 2 mL 的 DAPI 于 100 ％ 甲醇中，避光保存于 0 至 8 ℃ 的冰箱，保存期限為 2 星期�！� 染液：以 PBS 稀釋 5000 倍，即取 10 μL 的儲備液， 以 50 mL 的 PBS 稀釋，使用前配制不得過夜使用。
（十五）卵囊體及休眠孢子標準添加液：具活性的的隱孢子蟲及梨形鞭毛蟲可以用加熱 75 ℃ 以上一分鐘或 37 ﹪ 福爾馬林使之失去活性。
（十六）0.01 ％ Tween - 20 溶液：量取 1 mL 的 10 ％ Tween - 20 于 1 L 的試劑水中。

六、采樣與保存
（一）水樣現(xiàn)埸過濾或以 10 ～ 20 公升的塑料桶采集，運送至實驗室進行過濾濃縮分離等步驟。樣品運送及保存應(yīng)保持在0至8℃。但不得冰凍。
（二）樣品在采樣之后的 72 小時之內(nèi)要完成前處理，已染色之樣本玻片應(yīng)保存在暗處及 0 至 8 ℃ 冰箱中。
（三）已染色樣本最好能立即鏡檢觀察，至遲在 72 小時之內(nèi)要完成觀察計數(shù)。如果染色之效果不佳，則必須縮短保存期限或者提高 DAPI 染劑之濃度。

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