根段培養(yǎng)and有絲分裂周期的測(cè)定步驟

種植與萌發(fā)
1. 將豌豆種子以未稀釋之漂白水chlorox攪拌6-7分鐘。
2. 在無(wú)菌操作臺(tái)將豌豆倒在覆有紗布的燒杯上。用火消毒鑷子后將植物種子種在無(wú)菌的蛭石盆中。澆灌一瓶無(wú)菌水。把下種后的蛭石盆放在暗處4-5天，根部將可長(zhǎng)到3-6 cm長(zhǎng)。（注意計(jì)時(shí)）
4.    在剪下萌芽的根之前24小時(shí)，將下列器具放置在無(wú)菌接種臺(tái)進(jìn)行紫外光（UV light）照射。
a）大培養(yǎng)皿的底部（作為切割板）。
b）兩個(gè)無(wú)菌的二次蒸餾水滴瓶。
c）一只鑷子。
d）一只外科用刀片和刀柄。
e）全部以鋁箔及紙巾包覆后，放在有鋁箔覆蓋的鋼盤(pán)上。
f）將培養(yǎng)用三角瓶放置在無(wú)菌臺(tái)之外。
根尖的切除
1. 用酒精燒烤培養(yǎng)皿且使其冷卻；燒烤解剖工具且使其冷卻下來(lái)。（注意：工具必需總是保持無(wú)菌狀態(tài)，但不是熱的。）
2. 放置幾滴無(wú)菌水在培養(yǎng)皿內(nèi)且移出足夠的豌豆苗（12株），足供一三角瓶之培養(yǎng)。
3. 自每一個(gè)根段切下尖端1公分。切完12個(gè)根尖之后，打開(kāi)三角瓶，以火燒烤瓶頸且小心把根放入三角燒瓶后覆蓋瓶口。重復(fù)此切根步驟。直到4個(gè)燒瓶全取樣完成。

培養(yǎng)，后標(biāo)定與取樣
1. 24小時(shí)后，加入0.025 ml 3H-TdR（講員將示范）到每一個(gè)燒杯約標(biāo)定30分鐘。在標(biāo)定后把根倒入覆有無(wú)菌紗布的燒杯上。且使用無(wú)菌技術(shù)將根轉(zhuǎn)移到新鮮干凈沒(méi)有3H-TdR的新鮮White氏培養(yǎng)液中。
2. 在標(biāo)定后，用無(wú)菌取樣技術(shù)，每4小時(shí)取樣四個(gè)根尖，即在0、4、8、12、16、20和24小時(shí)取樣。（燒烤瓶頸，烤燒長(zhǎng)鑷子然后抽檢根尖----在無(wú)菌臺(tái)中工作）注意：分配取樣時(shí)間，或盡可能的錯(cuò)開(kāi)試驗(yàn)。
3. 將取樣的根放置在新鮮的固定液瓶中（100％乙醇：冰醋酸3：1）。把瓶子暫放在冰箱中直到全部的樣品取樣完成。在每一個(gè)瓶子內(nèi)投入鉛筆書(shū)寫(xiě)的卡片卷標(biāo)。
4. 將根進(jìn)行Feulgen染色且準(zhǔn)備壓片。
5. 進(jìn)行自動(dòng)放射線顯影------在4℃下進(jìn)行12天之曝光，即將涂有感光乳劑之玻片接受3H放射線之感應(yīng)作用。
計(jì)數(shù)
1. 顯影，封上蓋玻片和記數(shù)含放射線標(biāo)定且進(jìn)行細(xì)胞分裂的細(xì)胞數(shù)之百分比（labelled division figures, ％L.M.F.）。
2. 每一取樣時(shí)段至少計(jì)數(shù)四段根，每根至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。將取樣時(shí)間與放射線標(biāo)定，且進(jìn)行細(xì)胞分裂百分比（％）之關(guān)系作成相關(guān)之坐標(biāo)圖。
3. 由作圖之?dāng)?shù)據(jù)推算大略的細(xì)胞分裂周期之時(shí)間，及G1、S、G2、M分別所占之時(shí)間。


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