細(xì)胞冷凍保存實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)步驟？！

1.從冰箱中取出要用到的材料，并利用37℃水浴槽回溫。

2.關(guān)閉無菌操作臺(tái)UV燈，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇及日光燈。噴酒精于無菌操作臺(tái)平面，并擦拭乾淨(jìng)，以達(dá)到消毒效果。

3.將要使用到的物品，噴酒精消毒，并擦拭乾淨(jìng)，再帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

4.于無菌操作臺(tái)內(nèi)配置5% DMSO (1 DMSO比19 FBS溷合)，并放在冰上。

5.將要冷凍保存的細(xì)胞，噴酒精消毒，并擦拭乾淨(jìng)，再帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

6.將玻璃吸管接再pump的塑膠吸管上。

7.去除細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入PBS清洗細(xì)胞，并來回輕輕搖擺幾次。

*15公分Dish，加入10ml PBS；9公分Dish，加入5ml PBS。

8.去除PBS，再加入Trypsin。

*15公分Dish，加入5ml Trypsin；9公分Dish，加入3ml Trypsin。

9.放入細(xì)胞培養(yǎng)箱 (37℃) 3~5分鐘，以加速酵素作用，使附著型細(xì)胞漂浮起來。

10.輕輕拍打幾次，再利用顯微鏡觀察細(xì)胞是否全部漂浮起來。

11.噴酒精消毒，并擦拭乾淨(jìng)，再帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

12.加入與Trypsin同樣體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，并來回輕輕搖擺幾次溷合，以綜合酵素，阻止酵素繼續(xù)反應(yīng)。

13.吸取細(xì)胞液放入離心管。

14.抽取1ml細(xì)胞液放入微量離心管。

15.計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

16.細(xì)胞液給予離心。 (轉(zhuǎn)速1000rpm，溫度20℃，5分鐘)

17.去除上清液，加入配製好的5% DMSO。

18.利用微量吸管來回吸取，使細(xì)胞與5% DMSO完全平均溷合。

19.以1ml體積細(xì)胞液，個(gè)別分裝到抗凍管內(nèi)，并給予標(biāo)記細(xì)胞，代數(shù)及日期。

20.冷凍保存:冷凍管置于4℃，30分鐘→移至-20℃，30分鐘→移至-80℃，隔夜→移至液態(tài)氮桶長期保存。

*或直接放入Freeze Container，移至-80℃，隔夜→移至液態(tài)氮桶長期保存。

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